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1細胞マルチオームの実験と得られるデータ形式

1細胞マルチオームの実験と得られるデータ形式

目次

実験手順の概要

1. scATAC-seq用の前処理

  • 細胞膜を破砕し核を抽出。

  • Tn5トランスポザーゼを加えてクロマチンの開いた領域を切断し、両端にアダプター配列を付加した断片を核内に作成。

2. ライブラリ調製

  • アダプター配列付きオープンクロマチンの断片を含む核1つに対して1つのGEMを作成。このステップで1細胞毎に分ける。

  • 核内のmRNAをGEMに含まれるオリゴ(dT)プライマーで捕捉し、逆転写反応でcDNAを合成。このステップで細胞識別用のバーコードを付加する。

  • ATACでの前処理で得られたアダプター配列付き断片に対してもPCRを利用して細胞識別用のバーコードを付加。

  • 上記のcDNAとATAC断片由来に付加するバーコードは同じ核由来であれば同一。これによりトランスクリプトームとオープンクロマチンの情報が同じ細胞由来として結びつけられる。

  • PCRを通してNGSによるシーケンスに必要なP5、P7などの配列を付加したライブラリを調製する。

3. シーケンスとデータ解析

  • mRNA由来のライブラリとATAC用のライブラリそれぞれについてNGSによるシーケンスを実施。

  • CellRanger ARCによってNGS由来のfastqデータがMatrix(行が細胞で列が遺伝子またはゲノム領域であるイメージ)に変換される。

  • 研究者が実施するバイオインフォマティクスの処理はMatrixデータを起点に実施していくのが通常のワークフロー。

実験手順の詳細

Step 1: 核の単離（Nuclei Isolation）

原理

本キットでは細胞膜を選択的に破壊し、核を損傷なく回収することが重要です。RNAとクロマチン情報を同時に取得するため、RNAの分解を抑えつつ、クロマチン構造を保持する条件で核を単離します。

手順

  1. 細胞をPBSで洗浄し、遠心（300–500 g, 5分）。

  2. **氷冷の核抽出バッファ（Nuclei Isolation Buffer）**に再懸濁し、数分間インキュベーション。

  3. Triton X-100 や NP-40を含む洗浄バッファで細胞膜を溶解。

  4. 70 µmフィルターで濾過し、核を精製。

  5. 顕微鏡で核の形態・破損率を確認。

  6. 核数を計測し、最終濃度は 300–1200 nuclei/µL に調整。

Step 2: Tn5トランスポジション（Chromatin Accessibility Tagging）

原理

Tn5トランスポザーゼが開いたクロマチン領域（オープンクロマチン）に結合し、DNAを切断しながらアダプター配列を挿入します（tagmentation）。

手順

  1. 単離した核にTn5 transposase mixを添加。

  2. 37℃で5分間インキュベート（キット推奨条件）。

  3. 反応を氷上で停止し、次のGEMステップへ進行。

Step 3: GEM生成（Gel Bead-in Emulsion）

原理

GEM（Gel Beads-in-Emulsion）は1細胞（または核）あたり1つのゲルビーズと反応液を閉じ込めた油中水滴で構成されます。ビーズにはRNA用およびATAC用のバーコード化オリゴが付与されています。

  • RNA: 5' - P7 - 10X Barcode - UMI - poly(dT) - 3'

  • ATAC: 5' - P5 - Tn5 adaptor - 10X Barcode - 3'

手順

  1. 核＋トランスポジション済DNAを10Xランチャーにロード。

  2. Chromium Next GEMチップに試薬類と一緒にセット。

  3. クロマチックエンカプセル化により、GEMが自動的に形成。

  4. 各GEM内では：

    • RNAがバーコードオリゴ(dT)に捕捉

    • 同時に、ATAC断片とバーコードが結合

Step 4: 逆転写反応とバーコード付与（Reverse Transcription and Barcoding）

原理

GEM内でmRNAが逆転写され、cDNAが10X固有のバーコード（+UMI）とともに合成されます。これにより、後工程で細胞由来の識別が可能になります。

手順

  1. GEMを42℃で逆転写反応（RT）インキュベート（~2時間）。

  2. エマルジョンをブレークし、バルクcDNAを精製（silica columnなど使用）。

  3. cDNAはATACライブラリと分離されて保持。

Step 5: PCR増幅（Library Amplification）

原理

RNA由来cDNAとATAC断片は、それぞれバーコード情報を保持した状態でPCR増幅されます。

手順

RNA部位:

  1. SPRI beadsで精製後、cDNAを一次PCRにより増幅（14–16サイクル程度）。

  2. 二次反応でP5/P7アダプターを付加して完成。

ATAC部位:

  1. Tagmentation済DNAをSPRIで精製。

  2. PCRで増幅し、同様にP5/P7アダプターを付加。

Step 6: ライブラリ精製・QC（Quality Control）

原理

サイズ選別や不純物除去を行うことで、**正しいサイズレンジ（RNA: ~400 bp、ATAC: ~300–600 bp）**のライブラリを取得します。

手順

  1. AMPure XP beadsでライブラリサイズ選別。

  2. Agilent BioanalyzerやTapeStationでライブラリのサイズ・濃度評価。

  3. qPCRでライブラリ定量（KAPA kit推奨）。

Step 7: シーケンス（Illumina platform）

原理

RNAおよびATACそれぞれのライブラリは独立にシーケンスされ、同一バーコードを使って解析上で統合されます。

推奨条件

RNA-seqライブラリ

  • Paired-end 28 bp (R1) + 90 bp (R2)

  • R1: cell barcode + UMI

  • R2: transcript

ATAC-seqライブラリ

  • Paired-end 50 bp (R1/R2)

Step 8: データ解析（Cell Ranger ARC）

原理

Cell Ranger ARCを用いて、RNAとATACデータをそれぞれマッピング・フィルタリング・細胞の同定を行います。さらに、同一細胞のRNAとクロマチンの統合解析が可能です。

主な出力

  • filtered_feature_bc_matrix (トランスクリプトーム)

    • barcodes.tsv.gz (細胞毎に付与されたバーコード一覧)

    • features.tsv.gz (遺伝子名一覧)

    • matrix.mtx.gz (リードカウント数の行列データ(実際は「行数、列数、カウント数」からなる圧縮された形式))

  • filtered_feature_bc_matrix.h5

  • atac_fragments.tsv.gz

  • peak_annotation.tsv

  • gene_activity_matrix

次の記事

次の記事ではscnapyを用いたscRNA-Seqデータの前処理について説明します。

https://www.bioinforest.com/vcell-scanpy