バイサルファイトシークエンシング
目次
原理
バイサルファイトシークエンシングの基本原理は、シトシン（C）と5-メチルシトシン（5mC）がバイサルファイトイオン（HSO3-）の存在下で異なる反応を示すことにあります。
具体的には、バイサルファイトはシトシン（C）をウラシル（U）に変換しますが、5-メチルシトシン（5mC）は変化しません。この特性を利用して、バイサルファイト処理した後のDNAシークエンスを読むことにより、メチル化シトシンの位置を明らかにすることができます。
実験手順
バイサルファイトシークエンシングは大まかに4つの手順で進行します。
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- DNA抽出：バイサルファイトシークエンシングを行うためには、まず対象となるDNAを抽出します。
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- バイサルファイト処理: 次にバイサルファイト処理が行われ、DNA内のシトシン（C）はウラシル（U）へと変換されます。この反応後、メチル化されていないシトシンは全てウラシルに変換され、メチル化されたシトシンのみがシトシンとして残ります。
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- PCR増幅: バイサルファイト処理したDNAは非常に不安定であるため、PCRによって増幅します。これにより、DNAの量を増やすとともに、シーケンスに必要な構造、すなわちライブラリーを作成します。
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- DNAシークエンシング：最後に、PCRで増幅されたDNAを次世代シーケンサーにより解析します。シーケンス結果を確認し、メチル化シトシンの位置を明らかにします。
なお、バイサルファイト処理では、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換され、次に行われるPCRでアデニンと対応する塩基として認識されます。一方、メチル化シトシンはバイサルファイト処理を受けてもシトシンのままであり、PCRにおいてグアニンと対応する塩基として認識されます。
課題
バイサルファイトシークエンシングにはいくつかの問題点や課題があります。
一つ目は、バイサルファイト処理によるDNAの劣化です。バイサルファイト処理はDNAに大きなストレスを与え、DNA分子を劣化させる可能性があります。
二つ目は、メチル化されたシトシンとヒドロキシメチル化されたシトシン（5hmC）の区別ができない点です。これらの課題に対する対応策として、バイサルファイトシークエンシング法の改良が進められています。