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Gibson assembly

Gibson assembly

目次

原理

Gibson Assembly システムは三つの異なる酵素反応を一つのバッファーで行うことで、複数のDNA断片を一括に繋ぎ合せることができるシステムです。

    1. 5’エキソヌクレアーゼがDNA断片およびベクターの末端について、片方の鎖のみ分解してオーバーハングな領域を作成します。
    1. ベクターとDNA断片のオーバーハングに存在する相同領域でアニーリングが生じます。
    1. DNAポリメラーゼが生じたギャップ(=相同領域以外)を埋めます。
    1. DNAリガーゼがフラグメント間の結合部位を繋ぎます。

実験手順

    1. PCRを使って目的のDNA断片を増幅します。増幅されたDNA断片は、ギブソンアセンブリーで組み合わされる予定の他のDNA断片と20塩基以上のオーバーハングを持つことが望ましいです。
    1. DNA断片を精製し、適当な濃度（通常は50-100 ng/μL）に希釈します。
    1. 各DNA断片を等モルになるように混合し、2.5Xのギブソンアセンブリーマスターミックスに加えます。
    1. 反応液を50℃で1時間インキュベートします。
    1. 架橋生成物を適当な細胞（通常は大腸菌）に導入し、寒天培地上で培養および選択します。
    1. 形質転換が成功したコロニーを選び出し、所望の改変が行われたことを確認します。

応用

ギブソンアセンブリーは、合成生物学におけるDNA構築の分野で広く活用されています。

典型的な応用例としては、遺伝子のクローニングや合成、突然変異導入、タンパク質機能改良、ベクター構築、人工染色体作製などがあります。

参考書籍

バイオ実験基本セット

バイオ実験イラストレイテッド

生命科学基礎セット